1.项目名称： SOD的抗溃疡性结肠炎非临床药效学研究

2.标的技术的内容、技术指标和参数：见附件“SOD的抗溃疡性结肠炎非临床药效学研究”实验方案。

3.项目期限：项目开始时间预计为2022年5月，具体时间以双方签订合同生效后为准，合作期限预计为一个月。

4.付款方式：按工作进度分两期支付。

4.1合同签订生效后，30日内支付40%。

4.2完成SOD的抗溃疡性结肠炎非临床药效学研究并出具报告后，10日内支付60%。

5.报价规定及投标资质：

5.1本项目投标报价需包括以下内容：

5.1.1根据招标文件说明所包括的一切研究项目内容。

5.1.2在合同实施期间因国家有关政策调整所可能需要的额外调整因素。

5.1.3参加议标编制投标报价所涉及的一切费用。

5.1.4如有优惠项目请明确说明，重大缺漏项目按废标处理。

5.2报价为含税价，要求开具增值税普通发票。

5.3本次招标采取一次性报价方式，并设置最高限价10万元，总报价超过10万元的按废标处理。

5.4投标机构应通过国家药物GLP认证。

6.评标办法：

6.1满足招标文件要求，以总价最低确定中标候选人。但如有故意压低价格的行为，或出现重大错漏报，将作为废标处理。

6.2本次招标不存在按投标报价由低到高的排序递补中标候选人的情况。若中标候选人放弃中标，则择机另行安排。

7.开标时间、地点及参与方式：

7.1开标时间及地点：2022年2月18日在漳州水仙药业股份有限公司会议室公开开标。

7.2参与方式：投标人应于投标截止时间前以现场递交或邮寄方式参与投标，地址为：福建省漳州市芗城区南山路1号，漳州水仙药业股份有限公司六楼招标办，收件人：游志成，电话：13779911798。以邮寄投标文件方式参与投标的，快递单上须注明投标单位名称和参与的招标项目编号及项目名称。开标之前为确保寄达，请事先与我司招标办确认。投标截止时间：2022年2月17日17:30，逾期招标人有权拒收。

8.投标文件要求：

投标文件分成三部分，每部分应分开密封装订：第一部分为资格文件，第二部分技术文件，第三部分为商务文件。

8.1资格文件编制一式一份，主要内容为详细的投标人资料，包括a.三证合一的《营业执照》；b.非法人代表到现场投标的需提供法人代表授权书；c.招标文件对投标人资格要求的其他资料。

8.2技术文件编制一式二份，包括技术开发内容、技术参数、完成时间，招标文件要求提供的其它技术方面的文件，等等。

8.3商务文件编制一式一份，包括以下内容：投标报价表（必须由法人代表或被授权人签字盖章）、商务偏离表（如付款方式等，未说明即默认响应本招标文件要求），等等。

8.4除投标报价书外，其他任何地方不得出现相关投标标价的任何内容。

9其他：

9.1.投标费用：无论投标过程中的作法和结果如何，投标方自行承担其所有与参加投标有关的全部费用。

9.2.投标文件和有关资料一律不退还。

9.3.投标文件和报价清单须经投标方单位盖章方视为有效。

9.4.出现以下情况者，投标方的投标文件将作为废标：

9.4.1.不符合我国法律、法规的投标文件。

9.4.2.虚报、谎报行为的投标。

9.4.3. “关于资格的声明函”未提供或提供不全。

9.4.4.对招标文件中项目期未作出响应、或投标文件中项目期不明确、或项目期不能满足招标方要求。

9.4.5.投标文件与招标文件规定的技术要求有严重不符合者。

9.5.解决合同纠纷的方式：双方协商解决，协商不成的，由合同签订地人民法院判决。

10.评标小组：评标小组由水仙药业公司有关部门人员组成。

11.联系方式：

招标办    游先生：0596-2302616 / 13779911798

技术交流  康颖：18811568072

招标人：漳州水仙药业股份有限公司

                        2022年2月11日

附件一：

投标单位法定代表人授权书

项目名称：            

日    期：            

至：                                （招标单位名称）

                            （投标单位名称），中华人民共和国合法企业，法定地址：                          

              （授权人姓名）特授权           （被授权人姓名）代表我公司全权办理针对上述项目的投标、谈判、签约等具体工作，并签署全部有关的文件、协议及合同。

我公司对被授权人的签名负全部责任。

在撤销授权的书面通知以前，本授权书一直有效。被授权人签署的所有文件（在授权书有效期内签署的）不因授权的撤销而失效。

授权人签名：                 被授权人签名：               

职务：                       职务：                       

投标单位（公章）

“SOD的抗溃疡性结肠炎非临床药效学研究”实验方案

   本实验拟采用两种化学造模法：DSS（葡聚糖硫酸钠）、OXZ（恶唑酮）。阳性对照选用口服给药的SASP（柳氮磺吡啶），或者直肠给药的5-ASA（5-氨基水杨酸、美沙拉嗪）。

1. DSS造模条件下口服TAT-SOD对溃疡性结肠炎（简称UC）大鼠的改善作用

1.1动物实验

    选取SD雄性大鼠至少36只，初始体重约220 g，随机分成6组，每组至少6只，分别为模型组、正常组、高、中、低剂量L-TAT-SOD（TAT-SOD脂质体）组和阳性对照组。造模期间，正常组自由饮用灭菌水，其余组大鼠连续7天自由饮用3.0 %（m/V）葡聚糖硫酸钠（dextra sulfate sodium，DSS），构建急性结肠炎大鼠模型。造模成功后，连续7天分别给予每只用药大鼠高、中、低剂量灌胃给药，所对应剂量分别为30000 U/kg、10000 U/kg 及3000 U/kg。实验分组如下：模型组，全程饮用含3% DSS 灭菌水+灌胃生理盐水；正常组，全程饮用不含DSS灭菌水+灌胃生理盐水；L-TAT-SOD组，全程饮用含3% DSS灭菌水+灌胃L-TAT-SOD；阳性对照组，全程饮用含3% DSS灭菌水+灌胃500 mg/kg SASP。

1.2 结肠损伤评价（DAI评分）

    通过疾病活动指数（disease activity index，DAI）评价大鼠的结肠损伤情况：每天记录大鼠体重、排便情况，评分后取平均值得出结肠炎模型大鼠DAI评分以及其变化趋势。

表1 DAI评分

DAI评分的计算公式为：

DAI=（体重下降+大便形态+血便）÷ 3。

1.3 结肠密度的测定

    给药7天后，解剖大鼠腹腔，找到结肠，位于回盲以下 2 cm处向下取材约10 cm至肛门以上2~3 cm。然后立即称重、测量长度。注意：取材过程中尽量不要破坏组织的完整性，尽量避免拉扯组织，保证组织的本身长度。

结肠密度以所取结肠的重量与长度的比值计算。

结肠密度（g/mL）＝组织重量（g）÷ 组织长度（cm）

1.4 结肠组织的HE染色

    取大鼠结肠组织做固定、脱水、石蜡包埋、切片、HE染色，再于显微镜下观察。具体步骤见参考文献^[26]。

1.5 血清及结肠组织样品制备

    从大鼠腹主动脉取血并按照盐酸羟胺法测血清中酶活与炎症细胞因子，具体步骤见试剂盒说明书。

收集血液于1.5mL Ep管中。室温静置1h后，以4,000rpm，4℃条件离心15min，吸取上清液血清，做好相应标记且分装后置于-80℃冰箱保存，以待后续促炎细胞因子与抗氧化指标测定，需避免反复冻融。

10%结肠组织匀浆上清液的制备：准确称取结肠组织并记录重量（mg），加入9倍的预冷生理盐水（μL），匀浆仪彻底研磨后以3,000rpm，4℃条件离心10min留取上清液，做好相应标记并分装后置于-80℃冰箱保存，以待后续促炎细胞因子与氧化应激相关指标测定，需避免反复冻融。

1.6 结肠紧密连接蛋白IHC

采用免疫组化(Immunohistochemistry, IHC)对结肠组织的紧密连接蛋白Occludin与ZO-1的表达量进行测定，以1.4步骤制备石蜡切片，其余步骤如下：切片脱蜡后修复抗原，以3%H₂O₂孵育后于组化圈内进行血清封闭，滴加一抗以4℃条件孵育过夜，滴加二抗以室温条件孵育50min，滴加DAB显色液使目的蛋白显现阳性信号，以苏木素复染细胞核后脱水透明，并以中性树胶封片后镜检，采集IHC切片图像信息。

IHC切片图像中目的蛋白呈棕褐色阳性表达，参照Yang等^[248]的方法，利用Image Pro-Plus v.6.0软件测定积分光密度与组织面积（n=6），二者比值平均光密度作为量化分析结肠组织切片中目的蛋白表达的指标。

1.7 氧化应激相关指标的测定

对已获得的小鼠血清，采用盐酸羟胺法测定其SOD酶活，具体操作步骤同南京建成生物工程研究所试剂盒。

对已获得的组织匀浆上清液，采用BCA试剂盒方法测定其中蛋白质含量。对组织匀浆上清液进行一定倍数的稀释后，采用南京建成试剂盒方法测定六项氧化应激相关指标SOD、CAT、MDA、GPx、GSH、GSSG与MPO的含量。

1.8促炎细胞因子的测定

采用Elabscience ELISA试剂盒方法进行测定大鼠血清与组织匀浆上清液中促炎细胞因子TNF-α、IL-6与IL-1β的含量。

1.9 实验数据处理与分析

采用Excel 2010、SPSS 25和GraphPad Prism 8软件对实验数据进行分析处理，结果以“平均值±标准误差（M±SEM）”进行表述，进行单因素方差分析（ANOVA）并进行Duncan检验，以p＜0.05为显著性差异。

2. OXZ造模条件下口服TAT-SOD对溃疡性结肠炎（简称UC）大鼠的改善作用

    本项造模实验除造模方法不同外，其它方法参考DSS法。

    OXZ 法诱导的实验性结肠炎动物模型的建立^*: 大鼠背部皮肤剃毛( 2 cm × 2 cm) ，剃毛处滴3%的OXZ( 溶解于100%乙醇) 0.2 mL，自然风干，1 d后重复1次，5 d后将直径 2 mm 的无菌聚乙烯管插入大肠约 8 cm， 灌入0.5% OXZ( 溶解于50%乙醇) 0.15 mL，注入后大鼠倒置 1 min， 防止倒流。待清醒后正常喂养， 正常对照组注入生理盐水^［9］。

* 胃肠病学和肝病学杂志 2013 年 12 月第 22 卷第 12 期, DSS、TNBS、OXZ 诱导结肠炎动物模型的对比。